简介

做过qPCR（荧光定量PCR）的小伙伴，可能会遇到这样的问题，明明已经按照文献的方法，照搬PCR引物，可还是每次结果都不一样。

其实原因有这么几个：

有些小伙伴可能会说，移液枪使用多么简单，怎么可能不会用？实际上，在使用移液枪，特别是微量移液枪的时候，我们往往会长期快速操作，也就是说在弹簧还没来得及恢复的时候，我们已经又按了一下了。这样可能导致的结果不用我多说，首先可能会导致……指关节受伤。当然，这些只是其次，最重要的是会影响移液量。

所以，关爱拇指，吸取液体时，保持1-2秒，给弹簧一个缓冲。当然，在加模板的时候，提高模板加样量，也可以尽可能减少每次加样的误差。

吸取液体的时候，需要把枪头插入凹液面底部，而不是插到凹液面的侧面。侧面比较容易产生气泡：

当然，你会说，每次枪头都插很深（莫名其妙觉得是在开车），但是这样的话，就很容易在枪头上沾上液滴，在微量的模板加样时，很容易导致加样量的误差。

二、RNA的降解，也就是RNA完整性的问题  

RNA的完整性，一般体现在电泳过程中18S和28S的亮度上，如果这两个条带的RNA亮度变低，甚至没有，就说明RNA的完整性应该会有损失。（但实际上现在没人去跑电泳）导致RNA完整性受损的原因有很多，比如：

包括镁离子，pH，温度，紫外线，福尔马林等等都会对你的RNA产生影响。所以，要处处小心。于是有人做了这样的实验，就是对于RNA的降解，有没有什么方法可以降低RNA降解对于qPCR的影响。

他们分别分析了3`端和5`端的扩增CT值，以及长片段和短片段的ΔCT，发现RNA的完整性缺失与3`端和5`端没多大关系，但是短片段会比长片段扩增效率更高。所以，qPCR引物设计的过程中，尽量把片段设计得短一点。

三、抑制物，这点相对难解决               

在反转录过程中或者PCR过程中都可能有抑制物，这些抑制物，比如Na离子，EDTA，SDS，酚，血红素，腐植酸等等，都会对qPCR结果产生影响。具体体现在扩增曲线里会是这样：

实际上去除抑制剂也只能在抽提的过程中尽量洗脱掉抑制剂，别的操作过程中其实也没什么办法（加促进剂可能又会产生不稳定因素）。

我们往往谨慎对待：引物、探针、Ct 值等，但也有一些小东西会被忽视，比如：ROX™。也许很多同学的第一反应是：总听人说起 ROX™，但它是什么？它在荧光定量 PCR 里起到什么作用呢？

其实和 FAM™、VIC™、SYBR™ Green 类似，ROX™ 也是一种在 qPCR 反应中能被 qPCR 仪检测到的荧光染料分子。但与其他染料不同，ROX™ 是一种惰性参比染料，也就是说，其荧光信号并不随着 PCR 扩增而增强。相反，ROX™ 的荧光信号值在反应中是基本保持不变的。

四、ROXTM  有什么问呢？             

其实，在 qPCR 反应中有许多反应本身的物理因素会影响信号检测，从而造成孔间数据的差异。例如：PCR 反应板本底信号不均一，PCR 管盖厚度有差异，同一反应体系在分装时出现了差异等因素。ROX™ 能帮助我们通过均一化校正消除这些因素的误差，从而提高数据精确性。

五、ROXTM  的工作原理？             

请大家注意看板上的两个孔，我们在每个孔中加入「完全等量」的样本，然后进行扩增。很快，30 个循环完成了。在每一个循环中，我们的仪器都会读取出一个荧光信号值。

理论上仪器检测出这两个孔的信号值应该是完全相同的，因为刚开始的时候样品是完全一样的。但实际上，由于移液器加样存在误差，耗材孔间不同等一系列差异，这两孔检测出的信号值并不相同。幸运的是，我们在两个孔中都加了相同的 ROX™，而我们的仪器也同时读取了 ROX™ 的信号值。

可以看到，ROX™ 信号和 qPCR 反应荧光信号都有差异。仔细思考大家会发现，反应本身的这些物理差异会对 ROX™ 信号和 qPCR 反应的荧光信号造成同等程度的影响。

重要的是，我们的仪器会在每一个循环中检测每一个反应孔的这两种信号，然后在反应结束后自动进行均一化处理。结合仪器自身的一系列荧光校准参数，最终您的数据精度会得到显著提高。顺便提一下，最终这个值也就是我们所说的 Rn 值，也表示报告基团的标准化荧光值。

六、两个关于ROXTM  的重点：          

第一，除非有些特殊情况，Applied Biosystems™ 提供给您的荧光定量预混液已经包含了最佳浓度的 ROX™，因此您无需再额外添加。

第二，所有 Applied Biosystems™ 实时荧光定量 PCR 软件是默认检测 ROX™ 并使用均一化数据，这会帮您提高数据精确性。如果您选用的试剂盒或者预混液不含 ROX™，依据您对实验的精度的要求不同，您可以另外采购 ROX™ 摸索最佳浓度优化实验，您也可以将参比荧光染料选项改为 None（无），放弃 ROX 校正。在没有 ROX™ 存在的情况下，我们建议选择参比荧光为 None 进行数据分析。

好了，看看你的操作过程中是不是有这样或者那样的问题，看看你的扩增曲线是不是有比较奇怪的变化，然后，进行改进吧。